rokazyme生產(chǎn)和銷(xiāo)售用于研究，診斷和工業(yè)測(cè)試目的的新型酶。該公司成立于2006年，是冰島生物技術(shù)公司Prokaria的副產(chǎn)品，該公司后來(lái)合并為非營(yíng)利性國(guó)有企業(yè)Matis。Prokazyme基于二十年的地?zé)嵘锟碧剑⑸锘蚪M學(xué)和酶發(fā)現(xiàn)。Prokazyme（作為中小企業(yè)）與馬蒂斯組成了一個(gè)研究聯(lián)盟，并共同參與了由歐盟資助的一些研究項(xiàng)目。持續(xù)的研發(fā)和與Matis的戰(zhàn)略聯(lián)盟使Prokazyme有機(jī)會(huì)開(kāi)發(fā)大量不斷增長(zhǎng)的嗜熱細(xì)菌和病毒基因數(shù)據(jù)庫(kù)，并繼續(xù)開(kāi)發(fā)新的*酶產(chǎn)品。

Ice and Fire Phosporylation Kit / PNK and Alkaline phosphatase

冰和火磷酸化試劑盒/ PNK和堿性磷酸酶

Ice and Fire™磷酸化試劑盒包括用于核酸5'末端標(biāo)記的優(yōu)化試劑。

Ice and Fire™磷酸化試劑盒包括用于核酸5'末端標(biāo)記的優(yōu)化試劑。該新方案通過(guò)結(jié)合不耐熱蝦堿性磷酸酶（SAP）的低溫活性和熱穩(wěn)定的ThermoPhage™多核苷酸激酶（PNK）的高溫活性，提供簡(jiǎn)單的“一步”處理。蝦堿性磷酸酶從核酸的5'末端消化單磷酸，二磷酸和三磷酸，留下5'羥基。PNK催化γ磷酸從ATP轉(zhuǎn)移到核酸分子的5'-OH。在簡(jiǎn)化的溫度控制程序中兩種酶的組合允許磷酸化核酸的快速和有效的5'末端標(biāo)記。

可作為50個(gè)反應(yīng)的套件提供。

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產(chǎn)品  ：  IaF170S  | Ice and Fire kit 50反應(yīng)  | 價(jià)格：220.00 EUR

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有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱下文或下載說(shuō)明書(shū)

背景：
Ice and Fire Phosphorylation試劑盒為核酸的5'末端標(biāo)記提供了優(yōu)化的試劑。簡(jiǎn)單的方案利用低溫和高溫來(lái)控制不耐熱的蝦堿性磷酸酶（SAP）和熱穩(wěn)定的ThermoPhage™多核苷酸激酶（PNK）在一種溶液和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液（專(zhuān)項(xiàng)技術(shù)申請(qǐng)中）中的活性。該試劑盒旨在用末端單磷酸，二磷酸或三磷酸標(biāo)記DNA或RNA分子的5'末端。其他核酸如PCR產(chǎn)物，寡核苷酸，限制性消化的質(zhì)粒DNA或復(fù)合物樣品RNA或DNA也可用該試劑盒標(biāo)記。基材實(shí)際上可以是任何長(zhǎng)度。具有5'-磷酸的核酸需要在激酶反應(yīng)之前去磷酸化。該試劑盒包括蝦堿性磷酸酶和熱穩(wěn)定多核苷酸激酶酶混合物。這允許在較低溫度下核酸的去磷酸化，然后在加入放射性標(biāo)記的[γ-32 P] ATP之前加熱滅活磷酸酶并通過(guò)新型熱穩(wěn)定多核苷酸激酶（1）進(jìn)行標(biāo)記。SAP變性和PNK反應(yīng)在70℃下進(jìn)行。加熱步驟后無(wú)法檢測(cè)到SAP活性，然后進(jìn)行PNK反應(yīng)。具有5'-羥基（-OH）基團(tuán)的核酸也可以使用該試劑盒標(biāo)記。在這種情況下，磷酸酶通過(guò)加熱直接滅活，然后加入γ放射性標(biāo)記的ATP并在70℃溫育。SAP變性和PNK反應(yīng)在70℃下進(jìn)行。加熱步驟后無(wú)法檢測(cè)到SAP活性，然后進(jìn)行PNK反應(yīng)。具有5'-羥基（-OH）基團(tuán)的核酸也可以使用該試劑盒標(biāo)記。在這種情況下，磷酸酶通過(guò)加熱直接滅活，然后加入γ放射性標(biāo)記的ATP并在70℃溫育。SAP變性和PNK反應(yīng)在70℃下進(jìn)行。加熱步驟后無(wú)法檢測(cè)到SAP活性，然后進(jìn)行PNK反應(yīng)。具有5'-羥基（-OH）基團(tuán)的核酸也可以使用該試劑盒標(biāo)記。在這種情況下，磷酸酶通過(guò)加熱直接滅活，然后加入γ放射性標(biāo)記的ATP并在70℃溫育。

優(yōu)點(diǎn)：

磷酸化核酸的有效5'末端標(biāo)記，單鏈或雙鏈

酶活性的簡(jiǎn)單溫度控制

在反應(yīng)之間不需要額外的清除步驟如苯酚/chloroform或旋轉(zhuǎn)柱，僅SAP的熱變性

單管格式，簡(jiǎn)化程序

應(yīng)用：5' - 磷酸化DNA和RNA的終標(biāo)記：

核酸酶保護(hù)測(cè)定

雜交印跡

定量PCR

產(chǎn)品組件：

10X反應(yīng)緩沖液

SAP / PNK酶混合物

磷酸化的ssDNA寡聚體（10pmol /μL）用作陽(yáng)性對(duì)照

套件未隨附的組件：

放射性標(biāo)記的γ-ATP [32P]

ATP

無(wú)核酸酶水

議定書(shū)：

核酸5'放射性標(biāo)記方案：冰與火磷酸化試劑盒提供對(duì)照和優(yōu)化試劑，可快速方便地標(biāo)記DNA或RNA

1）靶核酸的去磷酸化（SAP反應(yīng)）：
10x SAP / PNK緩沖液
2.5μLSAP/ PNK酶混合物1μL 
靶DNA / RNA 
10-100pmol無(wú)核酸酶水至
24μL在37°C孵育60分鐘

2）靶核酸的磷酸化（PNK反應(yīng)）：
在37℃溫育后，將樣品加熱至70℃。在70℃下15分鐘后，向反應(yīng)中加入XμL放射性標(biāo)記的[γ-32 P] ATP，相當(dāng)于待標(biāo)記末端的2-5摩爾過(guò)量ATP（例如使用7,000 Ci / mmol，150 mCi / ml [γ] -32 P] ATP，1μL約為25 pmol）。在70°C孵育另外30-60分鐘。冷卻至+ 4°C或置于冰上以阻止反應(yīng)。

任選：加入1mM EDTA和/或在95℃加熱反應(yīng)5分鐘以終止反應(yīng)。

任選：通過(guò)旋轉(zhuǎn)柱（例如Qiagen核苷酸去除試劑盒，目錄號(hào)28304或等效的旋轉(zhuǎn)柱）或如Sambrook等所述的PAGE凝膠純化來(lái)清潔探針。（2）。

放射性標(biāo)記的核酸現(xiàn)在可以使用了

第二議定書(shū)：

用于5'標(biāo)記5'羥基化核酸的方案：Prokazyme Ltd也提供ThermoPhage TM PNK用于標(biāo)記5'羥基化核酸，但I(xiàn)ce and Fire磷酸化試劑盒也可用于此類(lèi)應(yīng)用。

1）反應(yīng)混合物
10x SAP / PNK緩沖液
2.5μLSAP/ PNK酶混合物1μL 
靶DNA / RNA 
10-100pmol無(wú)核酸酶水至
24μL在70℃孵育15分鐘以滅活SAP酶。

2）靶核酸的多核苷酸激酶5'標(biāo)記：
將XμL放射性標(biāo)記的[γ-32 P] ATP加入到相當(dāng)于2-5摩爾過(guò)量ATP的反應(yīng)中，待標(biāo)記的末端（例如使用7,000 Ci / mmol，150 mCi） / ml [γ-32 P] ATP，1μL約為25pmol）。
在70°C孵育60分鐘。冷卻至+ 4°C或置于冰上以阻止反應(yīng)。

任選：加入1mM EDTA和/或在95℃加熱反應(yīng)5分鐘以終止反應(yīng)。

任選：通過(guò)旋轉(zhuǎn)柱（例如Qiagen核苷酸去除試劑盒，目錄號(hào)28304或等效的旋轉(zhuǎn)柱）或如Sambrook等所述的PAGE凝膠純化來(lái)清潔探針。（2）。

放射性標(biāo)記的核酸現(xiàn)在可以使用了

方案III：

沒(méi)有放射性ATP的磷酸化：該試劑盒也可用于在克隆程序等之前磷酸化5'羥基化核酸。

1）反應(yīng)混合物
10x SAP / PNK緩沖液
2.5μLSAP/ PNK酶混合物1μL 
靶DNA / RNA 1-500pmol無(wú)
核酸酶水至
24μL在70℃孵育15分鐘以滅活SAP酶。

2）靶核酸的多核苷酸激酶5'磷酸化：
將ATP加入到反應(yīng)中至終濃度為10-100μM（至少兩倍于核酸末端的磷酸化濃度）。
在70°C孵育60分鐘。冷卻至+ 4°C或置于冰上以阻止反應(yīng)。

任選：通過(guò)旋轉(zhuǎn)柱（例如Qiagen核苷酸去除試劑盒，目錄號(hào)28304或等效的旋轉(zhuǎn)柱）或如Sambrook等所述的PAGE凝膠純化來(lái)清潔探針。（2）。

現(xiàn)在核酸已準(zhǔn)備好用于克隆程序

評(píng)估協(xié)議：

如果需要確定特定放射性或如果研究人員想要評(píng)估反應(yīng)效率，則可以使用以下評(píng)估方案。請(qǐng)注意，此評(píng)估需要閃爍計(jì)數(shù)器，閃爍液和DE81過(guò)濾器或等效儀器和組件。將1μL反應(yīng)物稀釋至1/10并將1μL點(diǎn)稀釋至Whatman Inc.DE81過(guò)濾器（目錄號(hào)3658023）或其等同物。作為陽(yáng)性對(duì)照，將相同的量放在一個(gè)不經(jīng)過(guò)洗滌步驟的過(guò)濾器上。沒(méi)有酶混合物的反應(yīng)溶液可用作陰性對(duì)照并用樣品洗滌。將樣品和陰性對(duì)照濾膜在400ml磷酸鈉緩沖液pH7中洗滌兩次30分鐘，干燥并放入閃爍計(jì)數(shù)瓶中，加入閃爍液并在液體閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)放射性。為了確定標(biāo)記的核酸的比活性，計(jì)算摻入反應(yīng)中的總cpm并將其除以pmol中標(biāo)記的核酸的量。

（#total cpm合并*稀釋因子*體積）/（#total pmol核酸）

預(yù)期的比活性：
當(dāng)具有7000 Ci / mmol的比活性的[γ-32P] ATP用于激酶反應(yīng)時(shí)，核酸應(yīng)在參考日期標(biāo)記至至少1×10 6 cpm / pmol。在放射性標(biāo)記的ATP小瓶上標(biāo)明的參考日32P的衰變可以計(jì)算為:(原始cpm /μl）/（2（天/ 14.3））

參考文獻(xiàn)：

Blondal，T.，Hjorleifsdottir，S.，Aevarsson，A.，F(xiàn)ridjonsson，OH，Skirnisdottir，S.，Wheat，JO，Hermannsdottir，AG，Hreggvidsson，GO，Smith，AV and Kristjansson，JK（2005）J Biol Chem， 280,5188-5194。

Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，EF和T.，M。（1989）Molecular cloning，a laboratory manual。冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約冷泉港。

上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司是實(shí)驗(yàn)試劑一站式采購(gòu)服務(wù)商

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